葉綠素是光合作用最重要的產物，同時葉綠素含量也是植物重要的生理指標之一。因此，研究葉綠素的提取方法意義重大。葉綠素含量測定方法一般有分光光度法、活體葉綠素儀法和光聲光譜法，以分光光度法應用最廣泛。因所用提取葉綠素的溶劑不同又有多種測定方法，早期葉綠素測定廣泛采用葉綠素檢測儀，但該方法由于先研磨后除渣，工作量大、步驟多，且容易受光氧化而引起偏差，不適宜田間大量樣品的提取和測定。通過比較幾種不同混合提取液的提取，提出測定棉花葉片葉綠素含量的最佳方法為丙酮浸提法。分別對不同配比的丙酮、乙醇和水的混合液的浸提效果進行了研究，證明利用混合液進行葉綠素浸提的可行性。研究表明，丙酮與乙醇混合液提取葉綠素存在協同效應，且二者在等摩爾混合時提取效果最好，而研究認為，丙酮乙醇（2:1）混合液浸提葉綠素效果較好。該試驗在前人研究的基礎上進一步探討葉綠素含量測定各方法的優劣及快速測定的步驟，為小白菜田間大樣本葉綠素含量測定提供依據。
　　1 材料與方法
　　1.1 試驗材料
　　將新鮮小白菜葉片洗凈、晾干、去大葉脈后剪碎混勻。試驗采用752S紫外可見分光光度計，丙酮、95%乙醇等試劑均為分析純，試驗用水為二次水。
　　1.2 試驗方法
　　1.2.1 不同浸提液提取效果試驗
　　稱取0.5 g試材于試管中，剪取葉片成2 mm碎條，在室溫下立即用丙酮研磨法和直接浸提法（4種提取液：95%乙醇，丙酮、乙醇（1:1），95%乙醇、丙酮、水（4.5:4.5:1），丙酮、95%乙醇（2:1））提取葉綠素，3次重復。浸提在黑暗中進行，每支試管加入浸提液10 mL,并不時搖動，等葉片變白，約14 h后定容25 mL,測定吸光值。室溫下以相應試劑為參比，分別在645 nm和663 nm處測定吸光度，由Arnon公式計算葉綠素a與葉綠素b的含量。葉綠素a（chla）含量（mg/g）=（12.7×A663-2.697×A645）7×V/（1000W）；葉綠素b（chb）含量（mg/g）=（22.77×A645-4.687×A663）7×V/（1000W）；葉綠素總含量（mg/g）=chla含量+chlb含量。式中A663、A645分別為相應波長下的吸光度值，V為提取液體積，W為所取葉片質量。
　　1.2.2 不同浸提液提取效果及穩定性試驗
　　光穩定性試驗：將樣品于測定后見光放置，分別于放置1、3、5 h后再次測定提取液中葉綠素的變化，比較葉綠素在不同提取液中的穩定性。再使用葉面積測定儀測量小白菜葉的面積，熱穩定性試驗：用浸提法進行葉綠素提取試驗，取提取液10 mL于有塞試管中，水浴中加熱，分別在30、50、70℃條件下保溫10 min,冷卻到室溫后，測定葉綠素含量。
　　2 結果與分析
　　2.1 不同提取方法的提取效果及光穩定性比較
　　由表1~5可知，5種不同提取方法以混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法所得總葉綠素含量最高（為0.438）；乙醇浸提法最低（僅0.305）；其它3種提取方法相差不大。降解值以丙酮研磨法最快（為0.263）；混合液（乙醇B丙酮B水=4.5:4.5:1）浸提法其次（為0.208）；混合液（乙醇:丙酮=2:1）和混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法較慢（分別為0.185和0.165）。說明，丙酮研磨法可能因研磨過程破壞了葉綠體，所提取的葉綠素在光下極不穩定。而混合液（乙醇:丙酮=2:1）和混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法可獲得較高的葉綠素含量，同時在光下也有較好的穩定性。
　　隨見光時間的延長，各種提取方法均以葉綠素a降解值遠遠快于葉綠素b。不同提取方法葉綠素a降解值在0.133~0.288之間變化，而葉綠素b降解值0.020~0.053之間變化。另外，每種提取方法的chla/chlb值均隨見光時間的延長表現出逐漸減小的趨勢，也可反映出

　　表1 丙酮碾磨法所得葉綠素含量及光穩定性比較

　　表2 乙醇浸提法所得葉綠素含量及光穩定性比較

　　表3 乙醇:丙酮=1:1浸提法所得葉綠素含量及光穩定性比較

　　表4 乙醇:丙酮=2:1浸提法所得葉綠素含量及光穩定性比較

　　表5 乙醇:丙酮:水=4.5:4.5:1浸提法所得葉綠素含量及光穩定性比較
　　葉綠素a降解速度快于葉綠素b。說明在可見光下，葉綠素a較葉綠素b更易降解。
　　2.2 不同浸提液提取方法的熱穩定性比較
　　由表6可知，各浸提方法所得chla、chlb和Chla+b含量均隨溫度升高而降低，在70℃下，乙醇浸提法幾乎全變褐色，而其它處理仍可見到綠色，其中，以混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法Chla+b含量為最高。說明，單一乙醇浸提所得葉綠素含量較低且不穩定，而加入丙酮后葉綠素含量提高且較穩定。各處理chla/chlb值也隨溫度升高而減小，說明在高溫下葉綠素a較葉綠素b更易降解，與在光下的變化一致。

　　表6 不同提取方法的熱穩定性比較
　　3 小結與討論
　　混合液浸提法不但所得葉綠素含量高于乙醇浸提法，且對光熱的穩定性也優于乙醇浸提法。其中以混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提所得葉綠素含量最高。試驗中單一乙醇浸提所得葉綠素含量較低，且不穩定，當加入丙酮后葉綠素提取更完全，且穩定性較好。結果表明，丙酮與乙醇混合液提取葉綠素存在協同效應，且二者在等摩爾混合時提取效果最好，這與研究結果一致。
　　試驗中丙酮研磨法也可得到較高的葉綠素含量，這與前人研究結果不同，具體原因有待于進一步研究。
　　但因研磨法所提取的葉綠素在光下極不穩定，因而這種方法也不可取。綜合分析得出，小白菜葉綠素提取效果最好的是混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法，其次為混合液（乙醇:丙酮:水=4.5:4.5:1）浸提法和混合液（乙醇:丙酮=2:1）浸提法，丙酮研磨法和乙醇浸提法效果最差。
　　隨見光時間的延長和溫度的增加，各種提取方法均以葉綠素a降解值遠遠快于葉綠素b。說明葉綠素a降解速度快于葉綠素b,這與的研究結果一致。結果表明，影響葉綠素提取效率的關鍵是葉綠素a的提取速度及其穩定性保持。